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首页>技术与应用>药典专题

药典方法,你能重现吗? ----月旭第2次微信技术讲座笔录

发布时间:2016-07-28        内容来源:月旭科技

这次的主题是方法重现性问题?方法重现性是谁的问题?方法重现性问题分析思路。为什么要讲方法重现性问题?是什么原因让我们想和大家讨论这个话题呢?


真实情况就是,方法重现性问题被问到的比例较大,那说明遇到这一类问题的同行是比较多的。所以和大家探讨一下,这一类问题怎么更好地解决。



好了,进入今天的主题,今天的探讨主要从三个方面开始:重现性问题分类;重现性问题原因查找;重现性问题的解决思路。


方法重现性问题分类,我们从大方向上、泛泛地将重现性问题分为两大类。

一大类是标准方法一开始就不能重现,另一大类是之前做得好好的方法,突然不能重现。


那方法从一开始就不能重现,体现在哪些地方呢?有些方法要求了出峰时间,对应不上,还有一个就是相对保留时间对应不上,一般情况下,标准方法是使用相对保留时间对各峰进行定性,对应不上,是很头疼的事情,那偏差多少才能保证不会误判断呢,从10版药典到15版药典,我们技术团队和各药检所的老师都进行过相关问题的请教,没有一个统一明确的标准。所以我也没办法和大家说,如果大家有这方面的经验,也欢迎分享。

还有一种是出峰顺序改变。多个目标物的项目,一般出峰顺序就是方法中写的配制标准品溶液的顺序,但有时也不一样,所以新方法尽量做到单标定性,更换色谱柱品牌后也要求重新定性。分离度、理论塔板数达不到这样的情况就更常见了,这个进行相关的调试更换色谱柱。最后一种,检测结果达不到药典要求的数值,一种是含量,一种是限量,怎么办?后面给大家慢慢说来。


说今天的重点,标准方法不能重现怎么办?


    通过一个案例来说明,放心今天不给大家推荐药品,那放这么多阿奇霉素的图能干什么呢? 


以阿奇霉素这个项目为例,为什么选择这个项目?因为这是一个历史遗留问题,从10版药典开始,就很难重现了,当时是最后一个杂质的相对保留时间在多家色谱柱,多家客户都有差异,现在15版方法做了很大调整,我们看一下。


15版药典有关物质方法,用了流动相PH=8.2的一个梯度程序,难点就是同时分离8个物质,各峰之间的分离度要求大于1.2,这说明这个方法在一开始建立的时候至少有一组峰是很难达到1.5分离度的,主峰阿奇霉素保留时间在30-40min,灵敏度S/N>10.0


阿奇霉素的有关物质共8种,有6种是降解产物,杂质Q和R、I、J、H、B。


这是中检院提供系统适用性标准参考图谱。

杂质JI分离度在1.2多点。


阿奇霉素药典方法验证思路


首先第一步,具不同选择性的C18LP-C18柱。 杂质IS达不到1.2,主峰保留时间52min,超过药典要求,杂质B在梯度运行完后,没有发现目标峰,采用Plus-C18柱, J和 I 完全重合,保留时间符合要求,B也出的了。


采用Topsil  C18柱,主峰保留时间不符合要求,B没有溶剂。

采用Welchrom C18柱,主峰保留太长,J和I没有分开,Q和R达不到1.2


采用Polar-RP柱,出峰时间太短,根据出峰的峰面积大小初步判断,峰位改变了,没有单标就比较被动,只能多方推断。

采用AQ-C18柱。主峰保留时间能接受,但杂质B在梯度波动上出现,容易对积分准确性造成影响。


在四元低压下,主峰40min,J和I分离度肯定没有1.2,二元高压下,主峰38min,J和I完全分离,说明这个项目,仪器对它也有一定的影响。


不同柱温的影响,药典方法是要求30℃(适当时调整)选择了一个比较高的温度50℃,JI有分离趋势,但分离度小于1.2B未检出,H位置改变,那肯定不行。下面这张是30℃的图,可见提高柱温对分离没有影响。


AQ-C18柱基础上,考察不同流速对检测结果的影响,将流速从1.0变成1.1,其他与药典条件一致,1.1流速将杂质B成功避开了梯度波动,使其积分更准确。


问题完美解决?答案是NO,因为有客户反馈AQ柱不能做出与月旭实验室相同的数据,反而XB-C18有比较好的结果。


谱图是不是很标准,完全符合药典各种要求


针对这样的情况,让我静静地想想,看一下差别性在哪儿,查一下文献,市场反馈,还真让我找到了一篇重量级的文献。


由北京市药检所的老师发表的论文《阿奇霉素有关物质测定方法的优化》看色谱柱选择的部分。


文献中一共收载了5款色谱柱不同谱图的数据,资生堂两款,沃特斯一款,迪马一款,岛津一款,看一下图。资生堂 250mm长度分离不错,150mm长度的柱子杂质12没分开。


沃特斯的1,2,3,两组没分开。

迪马的是4,6没有分开,岛津的是2,3与4,6两组没有分开。由此可见,该方法在建立的时候就比较挑选色谱柱,那是不是起草方法的时候没科学的建立呢?当然不是,在建立多组分同时分离的项目的时候,本身多物质性质之间的差异,方法的耐受性就不可能很好,所以我们挑选具有某一类特殊选择性的色谱柱进行测试,那这个项目是不是选择这一款柱子就百分百能测试出符合药典要求的图谱。


这是某用户使用资生堂的色谱柱做的数据,J和I分离度0.4。


另一个用户使用资生堂色谱柱的测试结果0.9。


这是我们对这个项目的各种问题进行的一个小结。


针对这一类问题,我们的建议如上。


还有一种情况就是不管怎么调试都不能符合药典要求,系统适用性参数不合适还好调整,严重的是产品质量不符合要求,杂质限量不符合要求,那为什么出现这样的情况呢?那可能就是标准方法不适合您的样品,那是什么原因呢?可能是工艺不一样……和起草单位用的样品就是不一样?结果就是不能重现!产品就是不合格!那怎么办?


方法一,告诉生产部,产品不合格,后面的合作,我相信各位比我更清楚流程,各种繁琐。那还有一个方法,就是告诉相关单位方法有问题不能重现,要求更改方法。说到这个问题,我之前参加药典的培训的时候,讲方法的老师也提到这个,你们不愿意做验证,他们也很担心标准公布后有厂家说不能重现,因为他们也要做验证,因此我们共同呼吁。


在方法公示期一定要进行方法验证,重要的事情,我们老师说了要说七遍,我相信大家也记住了,很多厂家都觉得方法只是公示,又没有正式实施,我的日常工作都完成不了,哪有时间和精力?那月旭给大家一个建议。


交给月旭,月旭帮您看着您的项目,有公示后,我们再沟通验证的后续工作,有需求的朋友可以联系我们各地的销售人员。

那针对标准方法从一开始就不能重现,我们先说到这里。


之前的方法做得很好,突然不能重现怎么办?其实之前的方法一直在使用,也相当于是一个标准方法,后面在某一天不能重现,那可能原因会有哪些呢?


那会是些什么问题呢?一般考虑五大方面:样品、流动相、仪器、色谱柱、人员,样品选择同批次,配制了立即进样,哪怕你已经验证过样品溶液稳定性是很不错的。流动相重新使用干燥洁净的玻璃溶剂瓶配制,为什么强调干燥洁净?因为之前放置过流动相的瓶子就算是同样的溶剂,我们也不能完全保证不带入别的成分,保险起见,更换溶剂瓶。如果条件允许,用的全部流动相组分均使用新开启的。仪器的差异,前面说阿奇霉素的时候,给大家看了仪器差异的数据;色谱柱更换了一根新的,可能有差异;人员配制流动相之间的差异,都有可能导致结果突然异常,给大家看点案例。


地黄浸膏指纹图谱方法的建立


选择安捷伦1260仪器,在8min-11min出了5个峰,峰高也比较高,那确实是特征峰,作为管控峰之一。


人员、流动相、色谱柱、样品均不更换,只更换了仪器,却不能很好地重现之前的结果。


我们再看一下试剂之间的差异导致的不同,药典项目:硫酸双肼屈嗪有关物质检测,使用了CN氰基柱,流动相中有离子对试剂,有两个不同浓度的自身对照溶液。


离子对试剂用了进口的,看一下图,注意看对照1的峰形。



离子对试剂用了国产的,注意看对照2的峰形。



各参数都看一遍,拖尾因子有很大的改变,保留时间相差2min,分离度也有差异。


所有外界因素都没改变,就只换了一根色谱柱,那色谱柱引起差异的可能性比较大,看一下不同色谱柱之间的差异。


不好的图,峰很宽,柱效不高,分离度不好。



测试好的图,刚好更换了一根新的色谱柱,通过对两支色谱柱的比较,两支柱子是同批次填料,不同时间装填,柱效有差异,不好的柱效是16500,效果好的柱效是18309。出厂检测要求是大于16000,重新用一根柱效在18000以上的同批次的色谱柱效果很好,那是不是该色谱柱是质量问题呢?我认为不是,因为色谱柱是符合出厂检测要求的,是合格品,色谱柱的各质控参数和我们的原料药一样,是经过多方验证的,科学严谨的控制在一个很窄的范围内。而某些待测样品对色谱柱参数的某一项特别敏感的话,例如这个案例是对柱效比较敏感,这样就会比较依赖色谱柱的性能,一定程度上也是方法重现性较差的表现之一。


上面是针对今天的主题做一个小结


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